Д.А.Затейщиков, Л.О.Минушкина, В.Г.Баринов, Т.Е.Цимбалова, О.Ю.Кудряшова, Д.А.Чистяков, В.В.Носиков, Б.А.Сидоренко
Медицинский центр УД Президента РФ и
Государственный научный центр РФ "ГосНИИ генетика"
В последнее время значительное количество исследований посвящено поиску наследственных факторов, предрасполагающих к неблагоприятному течению основных сердечно-сосудистых заболеваний. Одно из основных направлений в этих исследованиях - изучение так называемых генов-кандидатов [1]. Среди большого числа генов-кандидатов привлекает внимание ген рецептора (тип 1) ангиотензина II (ГРАТ). Через этот тип рецептороа опосредуется не только констрикторное действие ангиотензина II, но и экспрессия факторов роста и пролиферация гладкой мускулатуры, а также стимуляция выброса ИТАП-II. По современным представлениям дисфункция эндотелия играет значимую роль в патогенезе атеросклероза и его осложнений.
Целью настоящей работы явилось изучение связи полиморфизма ГРАТ с параметрами гемостаза у больных ишемической болезнью сердца.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование включено 73 больных ишемической болезнью сердца: 42 мужчины и 31 женщина, поступивших в стационар по поводу нестабильной стенокардии. Средний возраст составил61,3+1,02 лет, артериальной гипертонией страдали 64 пациента, курили 30, у 28 в анамнезе был крупноочаговый инфаркт миокарда. Более 2 родственников первой степени родства, страдавших артериальной гипертонией либо ишемической болезнью сердца, либо перенесших инсульт было у 26 пациентов. Индекс Кетле составил в среднем 26,7+0,47 и был более 25 у 49 пациентов. Уровень холестерина в среднем составил 5,50+0,14 ммоль/л, у 28 больных уровень общего холестерина был более 5,2 ммоль/л. Больные обследовались сразу после клинической стабилизации, на 3-7 день после отмены гепарина. К этому моменту они не получали антикоагулянтной и антиагрегантной терапии за исключением аспирина, который назначался всем пациентам, не имеющим противопоказаний. Не включались больные с острым инфарктом миокарда, ОНМК, сахарным диабетом типа 1 и сахарным диабетом типа 2 среднетяжёлого и тяжёлого течения, системными заболеваниями, заболеваниями, требующие гормональной терапии, острыми инфекционными заболеваниями, нарушениями функции печени, терапией непрямыми антикоагулянтами, постоянной формой мерцательной аритмии, застойной сердечной недостаточностью III и IV ФК по NYHA.
Измеряли ингибитор тканевого активатора плазминогена, динамику протеина С и фактора Виллебранда при венозной окклюзии [2]. Измеряли так же уровни D-димера, фибриногена, антитромбина III, плазминогена и антиплазмина. Измерение проводили на автоматическом анализаторе Behring Coagulation Timer.
Для определения аллелей полиморфного участка (А1166С) гена сосудистого рецептора (тип 1) ангиотензина II проводилось выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых методом фенол-хлороформной экстракции. Термостабильную ДНК-полимеразу Taq получили от НПО "Биотех" (Москва), рестриктазу BstDEI - от НПО "Сибэнзим" (Новосибирск). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы в НПО "Синтол" (Москва). Полиморфный участок ГРАТамплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров:
AT1R-L (5`-CCTGCACCAT-GTTTTGAGGTTGAGTGAC-3`)
и
AT1R-R (5`-AAAATAACAGGACA-AAAGCAGGCTAGGGAG-3`),
Амплификацию полиморфного участка гена проводили на амплификаторе PHC-2 ("Techne", Великобритания).
Для идентификации аллелей продукты амплификации расщепляли с помощью рестриктазы BstDEI. Продукты расщепления разделяли с помощью электрофореза в 2%-ном геле. В результате амплификации участка ДНК, содержащего полиморфную последовательность А1166С ГРАТ, получается фрагмент длиной 352 пары нуклеотидов (п.н.). Фрагмент ДНК, содержащий аллель С1166, расщепляется рестриктазой BstDEI, образуя продукты размером 114 и 238 п.н.; в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А1166 остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 352 п.н. после обработки BstDEI соответствует генотипу АА, двух фрагментов (114 и 238 п.н.) - генотипу СС и трех (114, 238 и 352 п.н.) - гетерозиготе АС.
Статистический анализ проводился с использованием статистического пакета SPSS. Для протяженных переменных рассчитывали средние величины, их и ошибки. Для сравнения частот генотипов использовали критерий c2 Пирсона. Однофакторный дисперсионный анализ проводили для сравнения протяженных переменных в зависимости от генотипа. Статистически значимыми считали значения при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Распределение частот встречаемости генотипов ГРАТ (полиморфный участок А1166С) в целом по группе оказалось следующим: АА - 53,4%, АС - 34,2%, СС - 12,3. Отмечена достоверно большая частота встречаемости аллеля С и генотипа СС и АС среди больных (c2=6,70, р=0,035), имевших в анамнезе инфаркт миокарда (АА - 35,7%, АС - 42,9%, СС - 21,4%), однако, связь этих параметров оказалась не очень сильной (t-b Кенделла = 0,289, р=0,008).
Анализ связи полиморфизма ГРАТ с уровнем факторов гемостаза показал, что генотип СС коррелирует с более высоким уровнем альфа-2-антиплазмина - главного ингибитора плазмина, и увеличением концентрации протеина С при венозной окклюзии, что по нашим данным коррелирует с нарушением утилизации тромбина эндотелием.
Показатели системы гемостаза в группах больных
различными генотипами ГРАТ (полиморфный участок А1166С)
| ПАРАМЕТРЫ | Генотип AA (n=39) |
Генотип AC (n=25) |
Генотип CC (n=9) |
p |
| Плазминоген (%) | 104,0+2,2 | 113,5+3,8 | 109,9+4,5 | НД |
| Антиплазмин исходно (%) | 100,7± 2,12 | 104,9± 2,06 | 113,3± 5,56 | 0,035 |
| Протеин С исходно (%) | 120,6± 4,50 | 121,8± 6,00 | 124,0± 8,45 | НД |
| Динамика протеина С при ВОК (%) |
-4,7± 1,41 | -2,7± 1,67 | 10,4± 11,85 | 0,012 |
| Фактор Виллебранда исходно (%) | 112,0± 6,74 | 116,9± 7,60 | 104,3± 18,5 | НД |
| Динамика фактора Виллебранда при ВОК (%) | -4,0± 5,66 | -11,0± 4,08 | -8,0± 12,95 | НД |
| Ингибитор активатора плазминогена (МЕ) | 4,0+0,3 | 4,6+0,5 | 5,3+0,6 | НД |
| Антитромбин III (%) | 102,9+2,4 | 102,6+4,1 | 104,4+4,8 | НД |
| Фибриноген (г/л) | 3,63+0,17 | 4,09+0,24 | 3,86+0,48 | НД |
| Д-димер | 296,9+40,8 | 322,4+57,3 | 276,7+54,1 | НД |
К настоящему времени известно более 10 видов полиморфных участков ГРАТ. Нами для данной работы был избран наиболее полно изученный участок А1166С, основанный на замене остатка цитидина (С) на остаток аденина (А) в положении 1166 нуклеотидной последовательности ГРАТ. Несмотря на относительно небольшое количество больных, наша группа оказалась достаточно репрезентативной. Об этом свидетельствует тот факт, что нами, как и в предыдущих исследованиях [3,4] обнаружено увеличение частоты генотипа СС ГРАТ в группе больных, перенесших инфаркт миокарда.
Так в исследовании ECTIM [3] была показана ассоциация полиморфизма этого типа с инфарктом миокарда. В той же работе выявлен синергизм взаимодействия аллеля С1166 ГРАТ и аллеля D гена ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) как генетических факторов риска развития инфаркта миокарда. Подобная ассоциация была выявлена и в исследовании REGRESS, где риск развития инфаркта миокарда оценивался по данным двухлетнего наблюдения за 782 мужчинами со стабильной стенокардией, получающих терапию правастатином. Частота развития инфаркта миокарда оказалась достоверно выше среди больных с генотипом DD гена АПФ и у пациентов имеющих одновременно генотип DD гена АПФ и генотип СС ГРАТ [5].
Нами впервые показано, что полиморфизм ГРАТ коррелирует с динамикой протеина С при венозной окклюзии. Измерение динамики протеина С - белка, активируемого тромбином, связанным с его эндотелиальным рецептором - тромбомодулином является косвенной методикой оценки деятельности системы тромбомодулина в условиях in vivo [2] при активации свертывания венозной окклюзией. При этом увеличение протеина С при веноокклюзивном тесте совпадало с увеличением уровня фибринопепдида А – маркера тромбинемии. Другими словами, генотип СС сочетается с нарушением антитромбиновой функции эндотелия.
Другие маркеры эндотелиальной дисфункции - фактор Виллебранда и ингибитор активатора плазминогена оказались независимыми от генотипа ГРАТ. Кроме того, нами впервые обнаружено, что генотип СС этого гена ассоциирован с более высоким уровнем главного плазменного ингибитора плазмина – альфа -2 -антиплазмина.
Все указанные сдвиги в системе гемостаза можно обозначить, как протромботические. Кажется вполне правомерным предположение, что именно они, так же как и сосудодвигательная дисфункция эндотелия и способствуют увеличению частоты инфаркта миокарда в этой группе пациентов.
Таким образом, нами получены достоверные данные об связи СС генотипа с протромботическими изменениями гемостаза. Именно эти изменения могут приводить в дальнейшем к накоплению случаев инфаркта миокарда среди больных, имеющих С аллель ГРАТ.
Литература
1. R.Pratt, V.Dzau. Genomics and Hypertension. Concepts, Potential, and Opportunitis. Hypertension, 1999; 33 [part II]: 238-247.
2. Д.А.Затейщиков, А.Б.Добровольский, О.В. Аверков, А.Н.Сторожилова, Е.П.Панченко, Дж.Боннет, Н.А. Грацианский. Изучение антикоагулянтных свойств эндотелия с помощью стандартного веноокклюзивного теста. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1992, N12, C.605-608.
3. Bonnardeaux A, Tiret L., Poirier O., et al. Synergistic effects on angiotensin-convertising enzyme and angiotensin II receptor gene polymorphisms on risk of myocardial infarction. Lancet 1994; 344:910-3.
4. T. Fusazaki, K. Nakai, A. Ohira, T.Shiroto, T. Musya, S. Makita, R. Tachieda, K.Hiramori The significance of the angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism in myocardial infarction in the Japanese XX Congress of the European society of Cardiology Abstract: P1636.
5. P.P. van Geel, Y.M. Pinto, A.H. Zwinderman, R.H. Henning, J.W. Jukema, J.J.P. Kastelein, W.H. van Gilst. Synergistic effects of angiotensin converting enzyme and angiotensin-II type 1 receptor gene polymorphisms on ischaemic events. XX Congress of the European society of Cardiology, Abstract: 386.
